實驗秘籍 | 瑞孚迪「HTRF技術」：給你的實驗疊個BUFF！

來源: | 作者:/ | 發布時間: 2024-12-31 | 1204 次瀏覽 | ?? 點擊朗讀正文 ?? ? | 分享到:

實驗通關秘籍之

HTRF技術篇

給你的實驗疊個buff~

說起實驗室常用的免疫檢測方法，

首先想到的就是ELISA與Western Blot。

但是，面對難以省去的眾多實驗環節，

冗長的實驗周期以及繁瑣的操作流程，

即使是經驗豐富的科研er也難免翻車。

如果此刻的你苦實驗久矣，

不妨了解一下瑞孚迪HTRF技術！

Principle of HTRF

什么是「HTRF」技術？

原理

HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence)技術源自于諾貝爾獎成果，是一種同時兼具TR(Time Resolved，時間分辨)技術和FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光能量共振轉移)技術的在均相（溶液）反應體系中的分析技術，經過三十余年的技術沉淀，已被超萬篇高分文獻引用。

TR技術利用稀土元素中鑭系元素(Eu、Tb、Sm等)的獨特性質，其熒光比普通熒光持續時間更長，普通熒光的半衰期為納秒級，鑭系元素的半衰期是毫秒級，有6個數量級的差別。所以，在檢測時，每個激發光脈沖過后，通過延緩檢測時間，讓短壽命的熒光衰變掉后，再檢測稀土穴狀化合物的熒光強度，幾乎可以完全消除背景熒光的干擾，提高靈敏度，反映樣品的實際情況（圖1）。

圖1

FRET 技術（圖2）利用了2種熒光基團的能量轉移，這2種熒光基團分別稱為能量供體和能量受體。能量供體被外來光源激發（例如氙燈或激光），如果它與受體比較接近，可以將能量共振轉移到受體上，使受體受到激發，發出特定波長的發射光。當供體和受體分別與相互作用的2個生物分子結合，生物分子的結合可以將能量供體和受體拉到足夠近的距離，產生能量轉移。由于受體的發射光來自于能量轉移，所以實驗中不需要將未結合與已結合的分子分開，即不需要洗滌步驟，大大減少了實驗操作步驟。

圖2

HTRF技術同時應用了以上兩種技術原理。能量供體選擇鑭系元素銪(Eu)和鋱(Tb)的穴狀化合物，在這個穴狀化合物里，Eu或Tb被永久地嵌合在1個籠子里，結構非常穩定，對溫度、pH、金屬離子、螯合物等耐受性極強。HTRF的能量受體有2種，交聯別藻藍蛋白(cross-linked APC，商品名XL665)和小分子熒光探針d2，它們的光學性質相同，相對分子質量不同。前者相對分子質量為1.05×10⁵，實際上就是改良過的別藻藍蛋白(APC)。后者相對分子質量較小，約為1×10³，可減少空間位阻對實驗的可能影響, 因此應用更廣泛。HTRF 測定法通過將一個供體熒光素（長壽命熒光）或一個受體熒光素（短壽命熒光）各自耦合到兩個生物分子上從而來評估這兩個生物分子的相互作用。當這兩個生物分子靠得足夠近時，通過運用320nm光源激發供體熒光素后，便能測得兩種熒光染料之間的能量轉移，并且受體熒光素的665nm熒光強度與相互作用的生物分子數量成正比。而將此技術運用在雙抗上時，我們會使供體熒光素和受體熒光素各自與其中一種抗原蛋白相結合。當在檢測體系中存在可以同時結合這兩種抗原蛋白的雙抗時，便能夠將這兩種抗原蛋白聚集到一起，并在激發下形成能量共振轉移，且FRET信號與待測物濃度成正比（圖3）。在檢測時，通過延緩檢測時間，讓短壽命的熒光衰變掉后，再檢測熒光強度，消除背景熒光的干擾。同時HTRF 技術在均相（溶液）中一步反應，無需包被、封閉、洗滌等繁瑣的操作步驟。因此該技術具有背景低、特異性好、操作簡單、體系穩定等優點。

圖3